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近日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所(以下簡(jiǎn)稱作科所)作物轉(zhuǎn)基因及基因編輯技術(shù)與應(yīng)用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)融合利用水稻密碼子優(yōu)化的nCas9 (H840A)蛋白和逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，開(kāi)發(fā)了一種高效的植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)，成功精準(zhǔn)編輯了水稻的外源hptII突變基因和內(nèi)源OsEPSPS基因，獲得了精準(zhǔn)編輯純合和雜合植株。相關(guān)研究成果于3月25日在線發(fā)表于《分子植物》(Molecular Plant)。

近年來(lái)，CRISPR/Cas介導(dǎo)的植物基因組定點(diǎn)編輯、單堿基替換和同源重組體系的建立和利用，在農(nóng)作物基因功能研究和精準(zhǔn)育種中發(fā)揮了重要作用，展現(xiàn)了廣闊的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

然而，CRISPR/Cas介導(dǎo)的植物基因組定點(diǎn)敲除技術(shù)只能在基因組特定位點(diǎn)產(chǎn)生隨機(jī)插入和刪除。論文通訊作者、作科所研究員夏蘭琴介紹，由CRISPR/Cas系統(tǒng)衍生的胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器，只能在基因組靶向位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)C→T，G→A，A→G和T→C等4種單堿基轉(zhuǎn)換，還不能實(shí)現(xiàn)其它類型的堿基顛換。通過(guò)同源定向修復(fù)技術(shù)進(jìn)行基因組精確編輯，在植物中的效率依然非常低，只在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室可行。因此，迫切需要建立更高效的植物基因組精準(zhǔn)編輯技術(shù)體系。

基于動(dòng)物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)已經(jīng)取得的相關(guān)成果，該團(tuán)隊(duì)在作物中進(jìn)一步優(yōu)化該系統(tǒng)，構(gòu)建了高效植物引導(dǎo)編輯體系。他們將水稻密碼子優(yōu)化的逆轉(zhuǎn)錄酶突變體融合在具有雙核定位信號(hào)的nCas9蛋白的C末端，使用玉米增強(qiáng)型啟動(dòng)子Ubiquitin驅(qū)動(dòng)該融合基因表達(dá)，并添加了具有增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性的多聚腺苷酸結(jié)構(gòu)和豌豆Rubisco小亞基E9終止子，從而終止轉(zhuǎn)錄和翻譯。進(jìn)一步，使用水稻組成型Actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)引導(dǎo)編輯向?qū)NA和小向?qū)NA的共表達(dá)，采用體內(nèi)可自我剪切的tRNA間隔，同時(shí)添加了多聚腺苷酸結(jié)構(gòu)和Nos終止子，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和表達(dá)量。

研究人員利用上述植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)，分別對(duì)靶向水稻外源hptII突變基因和內(nèi)源OsEPSPS基因進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯，成功獲得了15株hptII精準(zhǔn)修飾純合植株和1株OsEPSPS基因精準(zhǔn)修飾雜合植株，精確編輯效率分別為9.38%和2.22%。

高效植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的建立，為水稻以及其他作物基因組精確編輯提供了有效工具，有望大大促進(jìn)農(nóng)作物定向遺傳改良的進(jìn)程。(記者 李晨)