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抗生素能救命，但抗生素濫用帶來的超級細(xì)菌耐藥也能致命。世衛(wèi)組織專家估計，到2050年，由于細(xì)菌對抗生素耐藥導(dǎo)致的死亡人數(shù)可能從目前估計的每年70萬人增加到每年1000萬人，世界生產(chǎn)總值的損失將達(dá)到100萬億美元。

科研人員在拉曼檢測板上滴加氘標(biāo)記后的尿液細(xì)菌標(biāo)本

近日，中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所（以下簡稱蘇州醫(yī)工所）聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院、英國牛津大學(xué)的科研團(tuán)隊，開發(fā)了一種適用于血液和尿液標(biāo)本的快速藥敏檢測方法（FRAST），相關(guān)研究成果發(fā)表于《分析化學(xué)》。

論文第一作者、蘇州醫(yī)工所研究員宋一之告訴《中國科學(xué)報》：“FRAST將尿液和血液標(biāo)本的藥敏檢測時間由3～4天分別縮短為3小時和21小時，有望讓抗生素精準(zhǔn)狙擊細(xì)菌?！?/p>

不夠快、不夠準(zhǔn)

“藥敏檢測如果能在獲得標(biāo)本當(dāng)天完成，是最理想的?！闭撐淖髡咧?、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院主任醫(yī)師徐曉剛向《中國科學(xué)報》解釋道，“只有拿到藥敏報告后，才可以實現(xiàn)精準(zhǔn)用藥。”

藥敏定量試驗中的MIC（minimum inhibitory concentration）值，即在體外抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度，一直是微生物藥敏試驗、抗菌藥效評價和臨床抗菌方案制定的主流標(biāo)準(zhǔn)與主要依據(jù)之一。

徐曉剛介紹說，普通細(xì)菌的培養(yǎng)至少需要一天時間，厭氧菌可能需要72個小時，之后再做藥敏試驗還需要大概20個小時。粗略計算下來，3～4天對藥敏檢測來說是一個必要時間。

由于尿液細(xì)菌含量相對血液來說要多，節(jié)約了細(xì)菌培養(yǎng)的時間，使尿液藥敏檢測比血液藥敏檢測用時短，但還是無法在一個工作日內(nèi)完成?，F(xiàn)在的藥敏檢測流程不僅耗時耗力，并且對體外生長緩慢的病菌無能為力。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，MIC只能從抑制細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)增這一角度反映與測量藥效，卻無法檢測處于NGMA（Non-Growing but Metabolically Active）狀態(tài)的病菌，即在藥物作用下已經(jīng)不再增殖但仍然具備代謝活性的存活細(xì)胞。如果在抗菌治療中成為漏網(wǎng)之魚，將貽誤病情，引起復(fù)發(fā)性感染。

徐曉剛在臨床中發(fā)現(xiàn)，這種狀態(tài)的病菌也是十分常見的，帶來的結(jié)果就是在治療感染類疾病時，存在濫用和過度使用抗生素的情況，進(jìn)而誘導(dǎo)耐藥菌乃至“超級細(xì)菌”的頻繁出現(xiàn)。

不夠快、不夠準(zhǔn)，已經(jīng)成為傳統(tǒng)方法制定抗菌治療方案中不可避免的現(xiàn)狀?？焖贆z測感染細(xì)菌的藥敏特性，對確保有效抗生素的使用和減少對廣譜藥物的需求起著關(guān)鍵作用。那么如何準(zhǔn)確且快速的判斷感染細(xì)菌的藥敏特性呢？

為什么用拉曼光譜

1928年，印度科學(xué)家拉曼在實驗室發(fā)現(xiàn)，單色入射光透射到物質(zhì)中的散射光包含與入射光頻率不同的光，即拉曼散射。拉曼也因此獲得諾貝爾獎。

近年來，英國牛津大學(xué)副教授黃巍一直利用拉曼光譜進(jìn)行單細(xì)胞的研究工作，同時也開發(fā)了拉曼與穩(wěn)定同位素標(biāo)記聯(lián)用技術(shù)，是一位將拉曼引入單細(xì)胞分析中先行者。

細(xì)菌大多是單細(xì)胞。黃巍在采訪中提及，單細(xì)胞拉曼圖譜最大的特點就是無需外源標(biāo)記，展現(xiàn)的是細(xì)胞的內(nèi)在信號，可以視為細(xì)胞的化學(xué)指紋或者化學(xué)畫像，又稱為細(xì)胞的表型，是基因和環(huán)境互相作用的結(jié)果。

宋一之曾師從于黃巍學(xué)習(xí)拉曼光譜技術(shù)，通過學(xué)術(shù)交流活動，他們與華山醫(yī)院抗生素研究所所長王明貴和徐曉剛相識。在兩位同時具有臨床和科研經(jīng)驗的醫(yī)生介紹臨床藥敏檢測的困局之后，宋一之和黃巍立刻啟動了單細(xì)胞拉曼光譜—重水標(biāo)記聯(lián)用技術(shù)對耐藥菌的檢測研究。

為什么選擇該項技術(shù)？宋一之向《中國科學(xué)報》介紹道，單細(xì)胞拉曼圖譜可以看作一個細(xì)胞所有分子拉曼光譜指紋的總和，而細(xì)胞代謝的變化或者其他內(nèi)在差異都會引起細(xì)胞表型的變化，并繼而反映在細(xì)胞拉曼光譜信息中。

研究發(fā)現(xiàn)，具有代謝活性的細(xì)菌在重水（氘代水）環(huán)境中會將氘元素整合進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，這一過程稱為氘標(biāo)記。氘標(biāo)記后的細(xì)菌的拉曼光譜中產(chǎn)生新的碳—氘特征峰，成為了單細(xì)胞水平細(xì)菌代謝活動的生物標(biāo)記物。

宋一之說：“在抗生素作用下，易感菌代謝活性會受到抑制，而耐藥菌則不受影響并產(chǎn)生明顯的碳—氘峰，這一過程不依賴于細(xì)菌的增殖，對樣品中細(xì)菌的數(shù)量要求也很低。因此通過單細(xì)胞拉曼光譜檢測細(xì)胞活性，可以克服臨床微生物試驗對長時間培養(yǎng)的要求，使快速藥敏成為可能?！边@就是基于拉曼光譜—重水標(biāo)記聯(lián)用技術(shù)的FRAST方法。

“從樣本到報告”的快速診斷

據(jù)悉，拉曼光譜—重水標(biāo)記聯(lián)用技術(shù)可以直接作用于單細(xì)胞而無需培養(yǎng)，并在幾分鐘內(nèi)鑒定病原微生物種類，通過標(biāo)記后（1～2小時）的拉曼特征峰，判定感染細(xì)菌的代謝活性，快速篩選有效抗生素種類。

以尿液感染標(biāo)本檢測為例，宋一之介紹了FRAST方法：“首先通過離心收集尿液中的細(xì)菌，之后在共聚焦顯微拉曼系統(tǒng)下，對細(xì)菌觀察并進(jìn)行拉曼指紋圖譜的采集，這一過程可判斷尿液中是否有菌及菌量。”

研究人員將采集到的拉曼光譜利用機(jī)器學(xué)習(xí)模型，與已經(jīng)建立的革蘭氏陰性菌和陽性菌的拉曼光譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，預(yù)測樣品中細(xì)菌的革蘭氏陰陽性，并以此選擇合適的藥敏板。在重水環(huán)境中與不同種類和不同濃度的抗生素作用1～2小時后，細(xì)菌的拉曼光譜再次被采集，并通過算法分析其碳—氘峰強(qiáng)度特征。

試驗過程中，研究人員對包含質(zhì)控菌株和血液與尿液原始標(biāo)本在內(nèi)的超過3000個樣本，采集了6萬余張單細(xì)胞拉曼光譜，并與臨床金標(biāo)準(zhǔn)（微量肉湯稀釋法或臨床自動藥敏系統(tǒng)）進(jìn)行了對比，結(jié)果顯示，F(xiàn)RAST方法對革蘭氏染色結(jié)果的預(yù)測準(zhǔn)確率為100%，藥敏結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)總體一致率大于88%。

“這是迄今為止拉曼—重水標(biāo)記聯(lián)用技術(shù)在病原菌藥敏檢測中最完整的研究數(shù)據(jù)集，因此對于該技術(shù)的臨床應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)作用?！彼我恢硎?，基于拉曼的革蘭氏染色預(yù)測方法的整合，使得FRAST成為相對獨立完整的測試方法，臨床醫(yī)生可以無需其他手段輔助，完成“從樣本到報告”的快速診斷。

該方法的優(yōu)勢在于，在顯微拉曼系統(tǒng)下，僅需幾十個細(xì)胞就可以獲得有代表性的結(jié)果；氘標(biāo)記不依賴細(xì)菌的生長，因此可以有效縮短時間。另外，與近年來發(fā)展較快的耐藥基因的分子診斷技術(shù)相比，F(xiàn)RAST藥敏是基于抗生素對細(xì)菌作用的表型，因此該結(jié)果不會因未知的耐藥機(jī)制或基因表達(dá)調(diào)控影響而產(chǎn)生對藥敏的誤判。

宋一之告訴《中國科學(xué)報》：“目前，臨床微生物檢驗流程中使用的技術(shù)多數(shù)由國外研究團(tuán)隊和公司提出并開發(fā)，F(xiàn)RAST等新技術(shù)的出現(xiàn)將有助于我國科研和醫(yī)務(wù)工作者實現(xiàn)彎道超車，在病原菌感染快速診斷技術(shù)與裝備方面形成原創(chuàng)技術(shù)與核心競爭力?！?/p>

他也指出該方法在技術(shù)層面存在的困難——快速檢測拉曼信號。“由于拉曼信號本身較弱，細(xì)菌個體比較小，如何快速、高靈敏地檢測到檢測信號是一個挑戰(zhàn)。”未來，宋一之等研究者希望借助拉曼信號增強(qiáng)技術(shù)和自動化手段，進(jìn)一步縮短時間、提升靈敏度，使其能更早的用于人類與病原菌的戰(zhàn)爭中。（沈春蕾）